Técnicas de Diagnóstico Microbiológico en la Infección Urinaria

Técnicas de Diagnóstico Microbiológico en la Infección Urinaria

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Precio:
20€

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Puntuación:
5
Analizado el 8 junio, 2017
Última edición:8 junio, 2017

Reseña:

La infección del tracto urinario (ITU) es uno de los padecimientos más frecuentes del ser humano. En esta revisión vamos desde la etiología y patogenia de la infección bacteriana, pasando por las técnicas necesarias para su correcto diagnóstico hasta las medidas profilácticas que se pueden implementar.

La infección del tracto urinario es la presencia y multiplicación de microorganismos en la vía urinaria con invasión de tejidos y con presencia de bacteriuria. Pueden encontrarse bacterias en la orina sin que haya infección debido a contaminación al recoger la muestra con bacterias de la flora uretral, genitales externos, o por un tiempo de conservación excesivo. La sola presencia de bacterias en orina no puede considerarse como criterio diagnóstico de ITU. En la mayoría de las ITU encontramos leucocitos en orina (piuria) como respuesta inflamatoria a la invasión tisular por bacterias. La presencia de leucocitos en orina sí se considera un indicador fiable de ITU y su determinación ayuda a establecer el diagnóstico de manera rápida.

El diagnóstico de certeza de la infección del tracto urinario se realiza mediante el cultivo de orina (urocultivo) que permite cuantificar el número de bacterias presentes en orina. La interpretación de los resultados de los cultivos de orinas se han venido efectuando según los criterios de E. Kass y M. Finland que en 1.956 establecieron, basados en un estudio de mujeres con diagnóstico clínico de pielonefritis, que la infección del tracto urinario (ITU) podía diagnosticarse mediante cultivo bacteriológico cuantitativo de la orina recogida mediante micción espontánea. Consideraron que recuentos iguales o superiores a 100.000 UFC/ml eran indicativos de bacteriuria en el 80-95 % de los casos (una o varias muestras positivas, respectivamente); estimaron indicativos de contaminación recuentos iguales o inferiores a 10.000 UFC/ml; y de interpretación dudosa las muestras con recuentos entre ambas cifras anteriores.

Estos conceptos tradicionales no tienen vigencia hoy en día. Los nuevos criterios de bacteriuria significativa se han definido valorando, entre otros aspectos, la presencia o ausencia de sintomatología, el sexo del enfermo, el método de recogida de la orina y el microorganismo aislado. Así , dichos criterios son los siguientes:

  • Mujeres sintomáticas (con síndrome uretral agudo y orina recogida por micción espontánea): recuento igual o superior a 100 UFC/mL de coli o recuento igual o superior a 100.000 UFC/ml de otras enterobacterias.
  • Hombres sintomáticos (con síndrome uretral agudo y orina recogida por micción espontánea): recuento igual o superior a 1.000 UFC/mL.
  • Mujeres y hombres asintomáticos: recuento igual o superior a 100.000 UFC/mL en dos muestras sucesivas de orina por micción espontánea con el mismo microorganismo.
  • Mujeres y hombres cateterizados: recuento igual o superior a 100 UFC/mL.
  • En cualquiera de los sexos y edades (sobre todo lactantes y niños pequeños en los que la recogida por micción espontánea es difícil o imposible) en las muestras de orina recogidas por punción suprapúbica, cualquier recuento es significativo.
  • Estos criterios anteriores se refieren a enterobacterias. En caso de aislarse hongos (Candida) , bacterias Gram positivas (Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium urealyticum, Actinobaculum spp.) y microorganismos de crecimiento lento, recuentos entre 10.000 y 100.000 UFC/ml se consideran significativos.

Aunque el cultivo de orina sigue siendo la técnica de referencia para el diagnóstico de ITU, se han desarrollado numerosas técnicas de diagnóstico rápido que permiten realizar en poco tiempo un diagnóstico presuntivo de ITU e instaurar tratamiento precozmente.

CULTIVO CUANTITATIVO (UROCULTIVO)

El cultivo de orina se realiza para cuantificar el número de bacterias por mililitro y se expresa como unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL). En teoría, cada UFC en el cultivo representa una bacteria viable en la muestra; sin embargo, cuando las bacterias en orina existen como agregados (estafilococos) o como cadenas (estreptococos) el número de UFC es inferior al número real de bacterias en la muestra. La técnica de cultivo cuantitativo más utilizada es la siembra con asa calibrada, que permite depositar sobre la superficie del medio de cultivo un volumen determinado de orina. Se utilizan asas calibradas desechables de volumen fijo de muestra pero, la forma de introducir el asa en la orina para obtener la muestra y sembrar puede originar diferencias de hasta el doble de volumen.

Con una correcta técnica de siembra y volumen homogéneamente distribuido en el medio de cultivo, se obtiene información sobre el número de UFC/mL del microorganismo presente en la muestra y además proporciona colonias bien aisladas para su identificación y pruebas de sensibilidad antibiótica.

Figura 1. Crecimiento de E. coli en placa.

Figura 1. Crecimiento de E. coli en placa.

A partir de esta metodología se han desarrollado diferentes técnicas de cultivo semicuantitativo de los que el más empleado es el método del Dip-Slide. Es una alternativa útil al cultivo clásico cuando no hay un fácil acceso al laboratorio. Consiste en una lengüeta de plástico recubierta por un medio de cultivo, que se introduce directamente en la orina. Una vez sumergida, se coloca nuevamente en su envase y se envía al laboratorio. El recuento de colonias se realiza por comparación con un control o estándar. La ventaja es que poder realizándolo por el propio paciente, comenzando la incubación durante el transporte, evitando el deterioro de la muestra con el paso del tiempo.

DETECCIÓN DE BACTERIURIA POR MICROSCOPÍA

La presencia de bacterias en la orina se puede detectar por análisis microscópico en fresco o mediante tinción Gram. Suele estar implantada esta última. La tinción de Gram de la orina sin centrifugar suministra información en el momento sobre la naturaleza de la infección y entonces información al clínico para seleccionar las medidas terapéuticas. Esta importante ventaja tiene inconvenientes, principalmente su baja sensibilidad para bajas concentraciones que hace que no sirva en el diagnóstico de la ITU no complicada donde recuentos bajos suelen ser frecuentes. Se utiliza entonces en sospechas de pielonefritis aguda donde es muy importante el conocimiento de la etiología de la infección y cabe esperar concentraciones bacterianas altas.

La tinción de Gram es un método sencillo y barato, con un volumen de entre 0,01 y 0,05 mL que se extiende en un portaobjetos de vidrio, se seca al aire, se tiñe y examina mediante objetivo de inmersión. Sin embargo, no es una técnica bien estandarizada y existen diferentes criterios para considerar la prueba como positiva. Debido a ello, no existe uniformidad en la literatura respecto a su utilidad. En adultos donde el valor de la bacteriuria puede ser controvertido, la tinción de Gram es poco útil y en general no se considera una prueba adecuada por su baja sensibilidad en población general.

Posiblemente será útil en el diagnóstico de la ITU sintomática en población especial como gestantes, población pediátrica, lactantes con síndrome febril con sintomatología difícil de detectar… En general en estos casos el valor de la bacteriuria es poco discutible.

DETECCIÓN DE PIURIA POR MICROSCOPÍA

La leucocituria o piuria puede ser detectada y cuantificada mediante técnica microscópica por recuento en cámara cuentaglóbulos, tinción o microscopía directa a partir de muestras centrifugadas o no centrifugadas. Sin embargo, el método de referencia para contaje de leucocitos en orina es la medida de la tasa de excreción leucocitaria (número de leucocitos excretados en 24 horas). Normalmente no es una técnica implementada en el estudio rutinario (se requiere orina de 24 horas).

En rutina asistencial, la cuantificación de leucocitos en orina se realiza generalmente mediante recuento en cámara cuentaglóbulos, determinando leucocitos/mL o tras centrifugación, determinando leucocitos/campo (L/c) en el sedimento urinario. Se realiza un examen de los elementos formes de la orina. Esta última técnica, aunque muy utilizada, está sujeta a numerosos errores y se correlaciona mal con la técnica de referencia (tasa de excreción de leucocitos). Además, debido a que los leucocitos de deterioran con facilidad si la muestra no se conserva adecuadamente, parece que su utilidad principal es su empleo en infección grave, principalmente pielonefritis donde la presencia de cilindros leucocitarios pueden ser de ayuda al diagnóstico.

A parte de su pobre estandarización y por ello baja reproducibilidad, se suele realizar en laboratorios de urgencias, en orina recogida sin ninguna precaución que evite la contaminación y en mujeres, es frecuente la aparición de falsos positivos por contaminación de la muestra con secreción vaginal. Se establece como límite de la normalidad 10 leucocitos por mililitro, que se correspondería grosso modo con 5 leucocitos por campo. Aunque la existencia de piuria es un buen indicador de ITU, su presencia debe valorarse siempre en relación a la situación clínica del paciente y a otros hallazgos de laboratorio.

DETECCIÓN DE PIURIA MEDIANTE ESTERASA LEUCOCITARIA Y BACTERIURIA MEDIANTE NITRATO REDUCTASA

La mayoría de los laboratorios usan pruebas rápidas que miden actividad de leucocito esterasa como método de detección del recuento de leucocitos. Los leucocitos humanos producen al menos 10 proteínas con actividad esterolítica, estas proteínas reaccionan con ésteres substratos produciendo derivados alcohol y ácidos, los cuales reaccionan con otros compuestos presentes en la tira produciendo una reacción colorimétrica. En base a la cantidad de esterasa, producirá mayor colorimetría. Su ventaja principal es la capacidad de detectar en la orina tanto esterasas provenientes de leucocitos intactos como esterasas libres presentes tras la lisis celular que tantas veces se produce por una mala conservación de la muestra. Sin embargo la prueba de la esterasa leucocitaria puede arrojar falsos positivos en muestras contaminadas por flujo vaginal o Trichomonas vaginalis, los cuales pueden actuar como fuentes de esterasas. Además en muestras con elevada densidad o niveles altos de glucosa, proteínas, ácido ascórbico o ácido oxálico también pueden producirse interferencias en la prueba y arrojar resultados falsos positivos.

Antibióticos del grupo de las cefalosporinas y tetraciclinas pueden interferir con la prueba. Aspecto importante a destacar, es el efecto del ácido bórico empleado como conservador en muchos sistemas de transporte de orina y que también puede interferir en la reacción. En base a lo anterior las pruebas de esterasa leucocitaria tienen en general baja sensibilidad y especificidad, bajo valor predictivo positivo, aunque su valor predictivo negativo es alto.

La bacteriuria también se puede detectar cuando las bacterias presentes en la orina son capaces de reducir los nitratos a nitritos. Su capacidad está limitada a la presencia de microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pero no es útil en casos de infección por Pseudomonas spp, Enterococcus spp. o S. saprophyticus, los cuales no producen nitrato reductasa.

La presencia de nitritos es altamente específica de bacteriuria (97%) con un valor predictivo positivo del 94% pero una sensibilidad que no alcanza el 50%. Además, la prueba requiere orina de primera hora de la mañana, ya que al menos son necesarias cuatro horas de permanencia de la orina en la vejiga para obtener niveles detectables.

La inmensa mayoría de sistemas comerciales detectan nitritos y esterasa leucocitaria, como indicadores de la presencia de bacteriuria y piuria. Existen numerosas evaluaciones sobre la capacidad de ambas pruebas en simultáneo a la hora de detectar una infección del tracto urinario, pero en conjunto son poco comparables por la poca homogeneidad de los estudios. En general se puede deducir que cuando se evalúan simultáneamente mejora la capacidad de detectar una infección del tracto urinario, sobre todo cuando la bacteriuria es importante. La detección simultánea de nitritos y esterasa leucocitaria sirve principalmente para descartar una bacteriuria en base a un resultado negativo, ya que sensibilidad es baja, pero su especificidad alta, con alto valor predictivo negativo.

Figura 2. Resultados posibles en un análisis de orina sistemático.

Figura 2. Resultados posibles en un análisis de orina sistemático.

DETECCIÓN DE BACTERIURIA Y PIURIA MEDIANTE SISTEMAS AUTOMATIZADOS

Existen en el mercado diferentes sistemas que permiten cribar de forma rápida las orinas con bacteriuria y/o piuria significativa y seleccionarlas para realizar un cultivo convencional. Normalmente asocian la citometría de flujo a un sistema de captura de imágenes digitales y posterior reconocimiento mediante un software. Clasifican las partículas presentes en la orina en función de la intensidad de fluorescencia previa tinción con dos colorantes: fenantridina con apetencia por los ácidos nucléicos, y carbocianina con afinidad por los fosfolípidos de las membranas celulares y las mitocondrias, impedancia eléctrica y ángulo de dispersión tras incidencia de un haz de luz láser. Este sistema emplea un canal separado para el recuento de bacterias. También se utiliza sondas fluorescentes altamente específicas capaces de unirse a bacterias, levaduras y leucocitos acoplado a un sistema de análisis computerizado de imagen, con un umbral de detección de bacterias de 10.000 UFC/mL.

Figura 3. Leucocituria captada en imagen por sistema automatizado.

Figura 3. Leucocituria captada en imagen por sistema automatizado.

Otros sistemas se fundamentan en la capacidad del ATP bacteriano en presencia del sistema enzimático luciferina-luciferasa de emitir luz, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de ATP y en consecuencia a la concentración de bacterias en la orina. Las evaluaciones de estos sistemas en general demuestran su utilidad para el cribado.

En general y en base a diferentes evaluaciones se puede deducir que la sensibilidad y especificidad de los distintos sistemas automáticos dependen del punto de corte empleado para discriminar bacteriuria significativa y este aspecto debe ser localmente determinado en base a la población a estudiar.

Algunos sistemas permiten la utilización de distintos puntos de corte simultáneos si el sistema se conecta a una base de datos local que suministre datos demográficos como la edad y procedencia del paciente.

  • Sistema Iris IQ2000: Citometría de flujo y sistema de capturas de imágenes digitales.
  • Sysmex UF-1000i: Fluorocitometría de flujo. Clasificación de partículas en función de la intensidad de fluorescencia, impedancia eléctrica y ángulo de dispersión.
  • Cellenium 160US: Sondas fluorescentes específicas (bacterias, levaduras y leucocitos) acoplado a sistema de captura de imágenes.
  • Coral UTI Screen: Emisión de luz por ATP bacteriano en presencia de luciferín-luciferasa.

Un aspecto a considerar es la poca capacidad de estos sistemas de discriminar orinas contaminadas, aunque suministran gráficas de lectura que podrían ayudar a determinar la naturaleza del microorganismo y orientar la etiología.

Dado el buen valor predictivo negativo de estos sistemas, su utilidad principal es la discriminación entre las orinas negativas y las consideradas positivas y el envío de estas últimas a cultivo convencional (aproximadamente el 30-40% de las recibidas).

DETECCIÓN DE BACTERIURIA MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES

Actualmente han aparecido en el mercado sistemas comerciales capaces de detectar los principales microorganismos causantes de infección urinaria mediante métodos moleculares. Se asocia una PCR multiplex a un sistema de hibridación en fase sólida capaz de detectar los 6 principales uropatógenos:

  • coli uropatógeno.
  • Proteus mirabilis.
  • pneumoniae.
  • saprophyticus.
  • aeruginosa.
  • Enterococcus faecalis.

Tiene poco peso en la práctica clínica habitual por su desembolso económico. Actualmente está poco evaluado en su práctica habitual.

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIURIA POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS MALDI-TOF)

La introducción de la identificación microbiana basada en el análisis de proteínas mediante espectrometría de masas MALDI-TOF ha permitido mejoras importantes en la rutina de trabajo de los laboratorios de Microbiología Clínica. Entre estas mejoras cabe destacar un ahorro significativo del tiempo necesario para llevar a cabo las identificaciones microbianas a partir de colonias.

En este sentido, una de las posibles aplicaciones de la técnica MALDI-TOF en la rutina de trabajo del laboratorio es lograr identificaciones microbianas a partir de las bacterias de las orinas, adelantando en 48/72 horas el resultado de la identificación microbiana si se compara con la identificación bioquímica clásica y en 24 horas si se compara con la identificación mediante MALDI-TOF a partir de colonias. Clínicamente este acortamiento del tiempo necesario para llevar a cabo el diagnóstico microbiológico a nivel de especie se traduce en un aumento de la supervivencia de pacientes con sepsis que presentan bacteriemia documentada, ya que, en estos pacientes, la administración adecuada de antibióticos es esencial para una evolución favorable.


Este artículo está basado en la tesina realizada por Fernando Hernández Pacho para el Máster en Microbiología y Enfermedades Infecciosas realizado en Formación Alcalá. En esta tesina también participan Francisco Javier Valero Chávez y Berta Alcober Sánchez.

0 0 677 08 junio, 2017 Tesinas junio 8, 2017
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Acerca del autor

Fernando Hernández Pacho Licenciado en Farmacia en 2010 por la Universidad de Salamanca. Farmacéutico Interno Residente en el Servicio de Análisis Clínicos en el Hospital Universitario Puerta del Mar de Cádiz. Máster en Microbiología y Enfermedades Infecciosas (2016-2017, Universidad San Jorge). Máster en Investigación Clínica y Gestión del Conocimiento Científico (2016-2017, Universidad Miguel de Cervantes). Experto en Bases del Diagnóstico en Hematología (2016, Universidad de Barcelona). Experto del Laboratorio Clínico y Hematológico (2016, Universidad San Jorge). Autor de 2 capítulos en manuales de formación continuada de la sociedad científica AEBM. 37 comunicaciones a congresos internacionales, nacionales y regionales. 3200 horas de cursos acreditados por la comisión de formación continuada de las profesiones sanitarias o acreditados por las universidades.

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